Nehevsengiya fîberên masûlkeyên îskeletî yên mirovan li derveyî zincîra giran a mîyozînê

Spas ji bo serdana nature.com. Guhertoya geroka ku hûn bikar tînin piştgiriya CSS-ê bi sînor e. Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku guhertoya herî dawî ya gerokê bikar bînin (an jî moda lihevhatinê di Internet Explorer-ê de neçalak bikin). Wekî din, ji bo ku piştgiriya domdar were misoger kirin, ev malper dê ji şêwaz û JavaScript-ê bêpar be.
Masûlkeya îskeletî tevneke heterojen e ku bi piranî ji mîyofîbrîlan pêk tê, ku di mirovan de bi gelemperî di sê celeb de têne dabeş kirin: yek "hêdî" (cure 1) û du "lez" (cure 2A û 2X). Lêbelê, nehevsengiya di navbera û di nav celebên mîyofîbrîl ên kevneşopî de hîn jî kêm tê fam kirin. Me nêzîkatiyên transkrîptomîk û proteomîk li ser 1050 û 1038 mîyofîbrîlên takekesî ji vastus lateralis a mirovan, bi rêzê ve, sepandin. Lêkolîna proteomîk mêr di nav xwe de digirt, û lêkolîna transkrîptomîk 10 mêr û 2 jin di nav xwe de digirt. Ji bilî îzoformên zincîra giran a mîyozîn, me proteînên metabolîk, proteînên rîbozomal, û proteînên girêdana hucreyî wekî çavkaniyên guherbariya navmîyofîbrîl a piralî destnîşan kirin. Wekî din, tevî destnîşankirina komên fîberên hêdî û bilez, daneyên me destnîşan dikin ku fîberên celeb 2X ji hêla fenotipîk ve ji fîberên din ên bilez-dizivirandinê nayên cûdakirin. Wekî din, dabeşkirina li ser bingeha zincîra giran a mîyozîn têrê nake ku fenotipa mîyofîbrê di mîyopatiyên nemalîn de rave bike. Bi tevayî, daneyên me heterojenîteya myofiber a piralî nîşan didin, ku çavkaniyên guherînê ji îzoformên zincîra giran a myozinê wêdetir diçin.
Heterojenîteya hucreyî taybetmendiyek xwerû ya hemî pergalên biyolojîk e, ku dihêle hucrey ji bo bicîhanîna hewcedariyên cûda yên tevn û hucreyan pispor bibin.1 Nêrîna kevneşopî ya nehetojenîteya fîberên masûlkeyên îskeletî ew bû ku neuronên motorî celebê fîberê di nav yekîneya motorê de diyar dikin, û ew celebê fîberê (ango, celebê 1, celebê 2A, û celebê 2X di mirovan de) ji hêla taybetmendiyên îzoformên zincîra giran a mîyozîn (MYH) ve tê destnîşankirin.2 Ev di destpêkê de li ser bingeha bêîstîqrariya pH-ya wan a ATPase bû,3,4 û paşê li ser îfadeya wan a molekulî ya MYH.5 Lêbelê, bi destnîşankirin û pejirandina paşê ya fîberên "tevlihev" ên ku gelek MYH-an bi rêjeyên cûda hev-îfade dikin, fîberên masûlkeyên îskeletî her ku diçe wekî berdewamiyek têne dîtin ne wekî celebên fîberên cihêreng.6 Tevî vê yekê, qad hîn jî bi giranî li ser MYH-ê wekî dabeşkerê sereke ji bo dabeşkirina mîyofîberê disekine, nêrînek ku bi îhtîmalek mezin ji hêla sînorkirin û xeletiyên girîng ên lêkolînên destpêkê yên rodentan ve bandor bûye ku profîlên îfadeya MYH-ê û rêza celebên fîberê ji yên di mirovan de cûda ne.2 Rewş ji hêla rastiya ku masûlkeyên îskeletî yên mirovan ên cûda rêzek cihêreng a celebên fîberê nîşan didin bêtir tevlihev dibe.7 Ew vastus lateralis masûlkeyek tevlihev e ku xwedan profîla îfadeya MYH ya navîn (û ji ber vê yekê nûner) e.7 Wekî din, hêsaniya nimûnegirtina wê ew dike masûlkeya herî baş lêkolînkirî di mirovan de.
Ji ber vê yekê, lêkolîna bêalî ya cihêrengiya fîberên masûlkeyên îskeletî bi karanîna amûrên "omîk" ên bihêz krîtîk e lê di heman demê de dijwar e, beşek ji ber xwezaya pir-navokî ya fîberên masûlkeyên îskeletî. Lêbelê, teknolojiyên transkriptomîk8,9 û proteomîk10 di salên dawî de ji ber pêşkeftinên cûrbecûr ên teknolojîk şoreşek di hesasiyetê de derbas kirine, ku rê dide analîzkirina masûlkeyên îskeletî di çareseriya yek-fîberî de. Di encamê de, di taybetmendiya cihêrengiya yek-fîberî û bersiva wan a li hember teşwîqên atrofîk û pîrbûnê de pêşkeftinek girîng çêbûye11,12,13,14,15,16,17,18. Ya girîng, van pêşkeftinên teknolojîk serîlêdanên klînîkî hene, ku rê dide taybetmendiya berfirehtir û rasttir a disregulasyona bi nexweşiyê ve girêdayî. Mînakî, patofîzyolojiya miyopatiya nemalîn, yek ji nexweşiyên masûlkeyên mîrasî yên herî gelemperî (MIM 605355 û MIM 161800), tevlihev û tevlihev e.19,20 Ji ber vê yekê, taybetmendiya çêtir a disregulasyona fîberên masûlkeyên îskeletî dikare bibe sedema pêşkeftinên girîng di têgihîştina me ya vê nexweşiyê de.
Me rêbazên analîza transkrîptomîk û proteomîk a fîberên masûlkeyên îskeletî yên yekane yên ku bi destan ji nimûneyên biyopsiya mirovan hatine veqetandin pêşxistin û wan li ser bi hezaran fîberan sepandin, ku rê da me ku em nehevsengiya hucreyî ya fîberên masûlkeyên îskeletî yên mirovan lêkolîn bikin. Di vê xebatê de, me hêza fenotipkirina transkrîptomîk û proteomîk a fîberên masûlkeyan nîşan da û proteînên girêdana metabolîk, rîbozomal û hucreyî wekî çavkaniyên girîng ên guherbariya navbera fîberan destnîşan kirin. Wekî din, bi karanîna vê xebata proteomîk, me girîngiya klînîkî ya miyopatiya nematod di fîberên masûlkeyên îskeletî yên yekane de diyar kir, û veguherînek hevrêzkirî ber bi fîberên ne-oksîdative serbixwe ji celebê fîberê li gorî MYH eşkere kir.
Ji bo lêkolîna nehevsengiya fîberên masûlkeyên îskeletî yên mirovan, me du herikên xebatê pêşxistin da ku analîza transkrîptom û proteomê ya fîberên masûlkeyên îskeletî yên yekane gengaz bikin (Wêne 1A û Wêneya Pêvek 1A). Me çend gavên metodolojîk pêşxistin û çêtir kirin, ji hilanîna nimûneyê û parastina yekparebûna RNA û proteînê bigire heya baştirkirina derana her nêzîkatiyê. Ji bo analîza transkrîptomê, ev bi danîna barkodên molekulî yên taybetî yên nimûneyê di gava destpêkê ya transkrîpsiyona berevajî de hate bidestxistin, ku rê da 96 fîber ji bo pêvajoyek paşîn a bi bandor werin kom kirin. Rêzkirina kûrtir (±1 mîlyon xwendin ji bo her fîberê) li gorî nêzîkatiyên kevneşopî yên şaneya yekane daneyên transkrîptomê bêtir dewlemend kir. 21 Ji bo proteomîkê, me gradientek kromatografîk a kurt (21 hûrdem) bi destxistina daneyên DIA-PASEF li ser spektrometreyek girseyî ya timsTOF bikar anî da ku kûrahiya proteomê baştir bikin dema ku derana bilind biparêzin. 22,23 Ji bo lêkolîna nehevsengiya fîberên masûlkeyên îskeletî yên saxlem, me transkrîptomên 1,050 fîberên ferdî ji 14 donorên mezin ên saxlem û proteomên 1,038 fîberan ji 5 donorên mezin ên saxlem taybetmendî kirin (Tabloya Pêvek 1). Di vê gotarê de, ev setên daneyan bi rêzê ve wekî transkrîptomên 1,000-fîber û proteom têne binavkirin. Nêzîkatiya me di analîzên transkrîptomîk û proteomîk ên 1,000-fîber de bi tevahî 27,237 transkrîpte û 2,983 proteîn tespît kir (Wêne 1A, Setên Daneyên Pêvek 1-2). Piştî fîltrekirina setên daneyên transkrîptomîk û proteomîk ji bo >1,000 genên tespîtkirî û nirxên derbasdar ên 50% ji bo her fîberê, analîzên biyoenformatîkî yên paşê ji bo 925 û 974 fîberan di transkrîptom û proteomê de, bi rêzê ve, hatin kirin. Piştî fîlterkirinê, bi navînî 4257 ± 1557 gen û 2015 ± 234 proteîn (navînî ± SD) li ser her fîberê hatin tespîtkirin, bi guherbariya nav-kesane ya sînorkirî (Wêneyên Pêvek 1B–C, Setên Daneyên Pêvek 3–4). Lêbelê, guherbariya di nav-mijarê de di nav beşdaran de bêtir diyar bû, dibe ku ji ber cûdahiyên di hilberîna RNA/proteînê de di navbera fîberên bi dirêjahî û deverên xaçerêyî yên cûda de. Ji bo piraniya proteînan (>2000), katsayiya guherbariyê ji% 20 kêmtir bû (Wêneya Pêvek 1D). Her du rêbazan destûr dan girtina rêzek dînamîk a fireh a transkript û proteînan bi îmzeyên pir diyarkirî yên girîng ji bo girjbûna masûlkeyan (mînak, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Wêneyên Pêvek 1E–F). Piraniya taybetmendiyên hatine destnîşankirin di navbera setên daneyên transkriptomîk û proteomîk de hevpar bûn (Wêneya Pêvek 1G), û şîdeta navînî ya UMI/LFQ ya van taybetmendiyan bi awayekî maqûl baş têkildar bûn (r = 0.52) (Wêneya Pêvek 1H).
Herikîna karê transkrîptomîk û proteomîkê (bi BioRender.com hatîye afirandin). BD Xêzên rêza dînamîk ji bo MYH7, MYH2, û MYH1, û eşikên hesabkirî ji bo destnîşankirina celebê fîberê. E, F Belavbûna îfadeya MYH li ser fîberan di setên daneyên transkrîptomîk û proteomîkê de. G, H Nexşeyên Nêzîkbûn û Projeksiyona Cûrbecûrîya Yekgirtî (UMAP) ji bo transkrîptomîk û proteomîkê yên ku ji hêla celebê fîberê ya li ser bingeha MYH-ê ve hatine rengkirin. I, J Nexşeyên taybetmendiyê yên ku îfadeya MYH7, MYH2, û MYH1 di setên daneyên transkrîptomîk û proteomîkê de nîşan didin.
Me di destpêkê de dest bi destnîşankirina celebê fîberê ya li ser bingeha MYH-ê kir, bi karanîna rêbazek çêtirînkirî ku sûdê ji hesasiyeta bilind û rêza dînamîk a îfadeya MYH-ê di setên daneyên omîksê de werdigire. Lêkolînên berê ji bo destnîşankirina fîberan wekî celebê 1-ê yê saf, celebê 2A, celebê 2X, an tevlihev li gorî rêjeyek diyarkirî ya îfadeya MYH-yên cûda 11,14,24, pîvanên kêfî bikar anîne. Me rêbazek cûda bikar anî ku tê de îfadeya her fîberê ji hêla MYH-yên ku me ji bo celebkirina fîberan bikar anîne ve hate rêzkirin: MYH7, MYH2, û MYH1, ku bi rêzê ve bi fîberên celebê 1, celebê 2A, û celebê 2X re têkildar in. Dûv re me bi awayekî matematîkî xala guheztina jêrîn a her xêza encam hesab kir û ew wekî pîvanek bikar anî da ku fîberan wekî erênî (li jor pîvanê) an neyînî (li jêr pîvanê) ji bo her MYH destnîşan bikin (Wêne 1B-D). Ev dane nîşan didin ku MYH7 (Wêne 1B) û MYH2 (Wêne 1C) li gorî asta proteînê profîlên îfadeya vekirî/veqetandî yên cihêrengtir li asta RNA-yê hene. Bi rastî, di asta proteînê de, pir kêm fîber MYH7 îfade nedikirin, û ti fîber %100 îfadeya MYH2 tunebû. Piştre me sînorên îfadeyê yên pêşwextkirî bikar anîn da ku celebên fîberên li ser bingeha MYH-ê ji bo hemî fîberên di her daneyê de destnîşan bikin. Mînakî, fîberên MYH7+/MYH2-/MYH1- ji bo celebê 1 hatin destnîşankirin, lê fîberên MYH7-/MYH2+/MYH1+ ji bo celebê tevlihev 2A/2X hatin destnîşankirin (ji bo ravekirina tevahî li Tabloya Pêvek 2 binêre). Bi komkirina hemî fîberan, me belavbûnek berbiçav a dişibihe celebên fîberên li ser bingeha MYH-ê hem di asta RNA (Wêne 1E) û hem jî di asta proteînê (Wêne 1F) de dît, di heman demê de pêkhateya nisbî ya celebên fîberên li ser bingeha MYH-ê di nav kesan de diguhere, wekî ku tê hêvîkirin (Wêneya Pêvek 2A). Piraniya fîberan wekî celebê paqij 1 (%34-35) an celebê 2A (%36-38) hatin dabeş kirin, her çend hejmareke girîng a fîberên celebê tevlihev 2A/2X jî hatin tespît kirin (%16-19). Cûdahiyek berbiçav ew e ku fîberên celebê 2X yên paqij tenê di asta RNA de dikarin werin tespît kirin, lê ne di asta proteînê de, ev yek nîşan dide ku derbirîna bilez a MYH bi kêmanî qismî piştî transkrîpsiyonê tê rêve kirin.
Me rêbaza xwe ya tîpkirina fîbera MYH ya li ser bingeha proteomîkê bi karanîna xala blottingê ya li ser bingeha antîkoran piştrast kir, û her du rêbazan di destnîşankirina fîberên celeb 1 û celeb 2A yên paqij de lihevkirinek 100% bi dest xistin (li Şekila Pêvek 2B binêre). Lêbelê, nêzîkatiya li ser bingeha proteomîkê di destnîşankirina fîberên tevlihev de hesastir, bibandortir bû, û rêjeya her gena MYH di her fîberê de pîvand. Ev dane bandora karanîna nêzîkatiyek objektîf û pir hesas a li ser bingeha omîkê ji bo taybetmendiya celebên fîberên masûlkeyên îskeletî nîşan didin.
Piştre me agahiyên hevbeş ên ku ji hêla transkrîptomîk û proteomîk ve hatine peyda kirin bikar anîn da ku mîyofîberan li gorî transkrîptoma wan a tevahî an proteomê bi awayekî objektîf dabeş bikin. Bi karanîna rêbaza nêzîkbûna û projeksiyona piralî ya yekreng (UMAP) ji bo kêmkirina pîvanê bo şeş pêkhateyên sereke (Wêneyên Pêvek 3A-B), me karibû guherbariya mîyofîberê di transkrîptomê (Wêne 1G) û proteomê (Wêne 1H) de xuyang bikin. Bi taybetî, mîyofîber di setên daneyên transkrîptomîk an proteomîk de ji hêla beşdaran (Wêneyên Pêvek 3C-D) an rojên ceribandinê (Wêneya Pêvek 3E) ve nehatine kom kirin, ku ev yek nîşan dide ku guherbariya di nav-mijaran de di fîberên masûlkeyên îskeletî de ji guherbariya di navbera-mijaran de bilindtir e. Di nexşeya UMAP de, du komên cihêreng ên ku mîyofîberên "lez" û "hêdî" temsîl dikin derketin holê (Wêne 1G-H). Mîyofîberên MYH7+ (hêdî) li qutba erênî ya UMAP1 kom bûn, lê mîyofîberên MYH2+ û MYH1+ (lez) li qutba neyînî ya UMAP1 kom bûn (Wêne 1I-J). Lêbelê, li gorî îfadeya MYH, di navbera celebên fîberên bilez-zivirandinê (ango, celeb 2A, celeb 2X, an tevlihev 2A/2X) de cûdahî nehat kirin, ku ev yek nîşan dide ku îfadeya MYH1 (Wêne 1I-J) an nîşankerên din ên klasîk ên mîyofîberê yên 2X wekî ACTN3 an MYLK2 (Wêneyên Pêvek 4A-B) dema ku tevahiya transkrîptom an proteom tê hesibandin, di navbera celebên mîyofîberê yên cûda de cûdahî nake. Wekî din, li gorî MYH2 û MYH7, çend transkrîpt an proteîn bi MYH1 re bi awayekî erênî têkildar bûn (Wêneyên Pêvek 4C-H), ku ev yek nîşan dide ku pirbûna MYH1 bi tevahî transkrîptom/proteoma mîyofîberê nîşan nade. Dema nirxandina îfadeya tevlihev a sê îzoformên MYH di asta UMAP de (Wêneyên Pêvek 4I-J) gihîştin encamên wekhev. Bi vî awayî, her çend fîberên 2X dikarin di asta transkrîptê de tenê li ser bingeha hejmartina MYH werin nas kirin jî, fîberên MYH1+ dema ku tevahiya transkrîptom an proteom tê hesibandin, ji fîberên din ên bilez nayên cûdakirin.
Wekî lêkolîneke destpêkê ya nehevsengiya fîberên hêdî li derveyî MYH, me çar proteînên taybetî yên celebê fîbera hêdî yên damezrandî nirxandin: TPM3, TNNT1, MYL3, û ATP2A22. Bincureyên fîberên hêdî di hem transkrîptomîkê (Wêneya Pêvek 5A) û hem jî proteomîkê (Wêneya Pêvek 5B) de korelasyonên Pearson ên bilind, her çend ne bêkêmasî bin jî, bi MYH7 re nîşan dan. Bi qasî %25 û %33 ji fîberên hêdî ji hêla hemî bincureyên gen/proteînê ve di transkrîptomîkê (Wêneya Pêvek 5C) û proteomîkê (Wêneya Pêvek 5D) de wekî fîberên hêdî yên paqij nehatine dabeşkirin. Ji ber vê yekê, dabeşkirina fîberên hêdî li ser bingeha gelek bincureyên gen/proteînê tevliheviyek zêde derdixe holê, tewra ji bo proteînên ku wekî celebê fîberê têne zanîn. Ev pêşniyar dike ku dabeşkirina fîberan li ser bingeha îzoformên malbateke gen/proteînê ya yekane dibe ku nehevsengiya rastîn a fîberên masûlkeyên îskeletî bi têra xwe nîşan nede.
Ji bo ku em guherbariya fenotipîk a fîberên masûlkeyên îskeletî yên mirovan di asta tevahiya modela omîkê de bêtir lêkolîn bikin, me kêmkirina pîvana bêalî ya daneyan bi karanîna analîza pêkhateya sereke (PCA) pêk anî (Wêne 2A). Mîna nexşeyên UMAP, ne beşdar û ne jî roja ceribandinê bandor li kombûna fîberan di asta PCA de nekir (Wêneyên Pêvek 6A-C). Di her du setên daneyan de, celebê fîberê ya li ser bingeha MYH-ê ji hêla PC2 ve hate ravekirin, ku komek fîberên celebê 1-ê yên hêdî-zivirandinê û komek duyemîn nîşan da ku celebê 2A-yê, celebê 2X-ê, û fîberên 2A/2X-ê yên tevlihev ên bilez dihewîne (Wêne 2A). Di her du setên daneyan de, ev her du kom bi hejmarek piçûk ji fîberên celebê 1/2A yên tevlihev ve girêdayî bûn. Wekî ku tê hêvî kirin, analîza zêde-nûnertiya ajokarên sereke yên PC-yê piştrast kir ku PC2 ji hêla îmzeyên girêkî û metabolîk ve tê rêve kirin (Wêne 2B û Wêneyên Pêvek 6D-E, Setên Daneyên Pêvek 5-6). Bi tevayî, cureya fîbera li ser bingeha MYH-ê ji bo ravekirina guherîna domdar a li ser PC2-ê têrker hat dîtin, ji bilî fîberên bi navê 2X ku li seranserê transkrîptomê di nav koma bilez de belav bûne.
A. Nexşeyên analîza pêkhateya sereke (PCA) ya setên daneyên transkrîptom û proteomê li gorî celebê fîberê li gorî MYH hatine rengkirin. B. Analîza dewlemendkirina ajokarên transkrîpt û proteînê di PC2 û PC1 de. Analîza îstatîstîkî bi karanîna pakêta clusterProfiler û nirxên p yên sererastkirî yên Benjamini-Hochberg hate kirin. C, D. Nexşeyên PCA li gorî termên ontolojiya gena girêdana navhucreyî (GO) di termên GO yên transkrîptom û costamere de di proteomê de hatine rengkirin. Tîr ajokarên transkrîpt û proteînê û rêwerzên wan temsîl dikin. E, F. Nexşeyên taybetmendiyên nêzîkbûn û projeksiyona piralî ya yekreng (UMAP) ya taybetmendiyên klînîkî yên têkildar ku gradyantên îfadeyê yên serbixwe ji celebê fîbera hêdî/lez nîşan didin. G, H. Têkiliyên di navbera ajokarên PC2 û PC1 de di transkrîptom û proteomê de.
Bi awayekî nediyar, celebê myofiber-a li ser bingeha MYH-ê tenê duyemîn pileya herî bilind a guherbariyê (PC2) rave kir, ku ev yek nîşan dide ku faktorên din ên biyolojîkî yên ku bi celebê myofiber-a li ser bingeha MYH-ê (PC1) ve ne girêdayî ne, di rêkxistina nehevsengiya fîberên masûlkeyên îskeletî de roleke girîng dilîzin. Analîza zêde-temsîlkirinê ya ajokarên sereke di PC1-ê de eşkere kir ku guherbariya di PC1-ê de bi giranî ji hêla girêdana hucre-hucre û naveroka rîbozomê di transkrîptomê de, û costamer û proteînên rîbozomal di proteomê de ve hatî destnîşankirin (Wêne 2B û Wêneyên Pêvek 6D-E, Koma Daneyên Pêvek 7). Di masûlkeyên îskeletî de, costamer dîska Z-ê bi sarkolemmayê ve girêdidin û di veguhestina hêzê û sînyalkirinê de beşdar in. 25 Nexşeyên PCA yên şîrovekirî bi karanîna taybetmendiyên girêdana hucre-hucreyê (transkrîptom, Wêne 2C) û costamere (proteom, Wêne 2D) veguheztinek çepê ya bihêz di PC1-ê de eşkere kirin, ku nîşan dide ku ev taybetmendî di hin fîberan de dewlemend in.
Lêkolîneke berfirehtir a kombûna mîyofîberê di asta UMAP de eşkere kir ku piraniya taybetmendiyan gradyana îfadeya MYH-ya serbixwe ya celebê mîyofîberê nîşan didin, ne ku taybetî ya binkomên mîyofîberê. Ev berdewamî ji bo çend genên ku bi şert û mercên patolojîk ve girêdayî ne (Wêne 2E) hate dîtin, wek CHCHD10 (nexweşiya neuromuskuler), SLIT3 (atrofiya masûlkeyan), CTDNEP1 (nexweşiya masûlkeyan). Ev berdewamî li seranserê proteomê jî hate dîtin, di nav de proteînên ku bi nexweşiyên neurolojîk (UGDH), sînyalkirina însulînê (PHIP), û transkrîpsiyonê (HIST1H2AB) ve girêdayî ne (Wêne 2F). Bi hev re, ev dane berdewamiya di nehevsengiya lerzîna hêdî/lez a serbixwe ya celebê fîberê de li seranserê mîyofîberên cûda nîşan didin.
Balkêş e ku genên ajokar di PC2 de têkiliyek baş a transkrîptom-proteomê nîşan dan (r = 0.663) (Wêne 2G), ku ev yek nîşan dide ku celebên fîberên hêdî- û bilez-dizivirin, û bi taybetî taybetmendiyên girêkî û metabolîk ên fîberên masûlkeyên îskeletî, bi awayekî transkrîpsiyonî têne rêkxistin. Lêbelê, genên ajokar di PC1 de têkiliyek transkrîptom-proteomê nîşan nedan (r = -0.027) (Wêne 2H), ku ev yek nîşan dide ku guhertoyên ku bi celebên fîberên hêdî/lez-dizivirin ve ne têkildar in, bi piranî piştî transkrîpsiyonê têne rêkxistin. Ji ber ku guhertoyên di PC1 de bi giranî bi şertên ontolojiya gena rîbozomal ve hatine ravekirin, û ji ber ku rîbozom bi beşdarbûna çalak û bandorkirina wergerandina proteînê di hucreyê de rolek girîng û pispor dilîzin,31 em paşê dest bi lêkolîna vê heterojenîteya rîbozomal a nediyar kirin.
Me pêşî nexşeya analîza pêkhateya sereke ya proteomîkê li gorî pirbûna nisbî ya proteînan di terma GOCC "rîbozoma sîtoplazmîk" de reng kir (Wêne 3A). Her çend ev term li aliyê erênî yê PC1 dewlemend be jî, ku di encamê de gradientek piçûk çêdibe, proteînên rîbozomal dabeşkirina PC1 di her du aliyan de dimeşînin (Wêne 3A). Proteînên rîbozomal ên li aliyê neyînî yê PC1 dewlemend bûne RPL18, RPS18, û RPS13 (Wêne 3B) dihewîne, di heman demê de RPL31, RPL35, û RPL38 (Wêne 3C) ajokarên sereke li aliyê erênî yê PC1 bûn. Bi balkêşî, RPL38 û RPS13 di masûlkeyên îskeletî de li gorî tevnên din pir zêde hatin îfade kirin (Wêneya Pêvek 7A). Ev îmzeyên rîbozomal ên cihêreng di PC1 de di transkrîptomê de nehatin dîtin (Wêneya Pêvek 7B), ku rêziknameya piştî-transkripsiyonê nîşan dide.
A. Nexşeya analîza pêkhateya sereke (PCA) li gorî termên ontolojiya gena rîbozomal a sîtoplazmayî (GO) li seranserê proteomê hatiye rengkirin. Tîr di nexşeya PCA de rêça guherîna bi navbeynkariya proteînê nîşan didin. Dirêjahiya xêzê bi puana pêkhateya sereke ya ji bo proteînek diyarkirî re têkildar e. B, C. Nexşeyên taybetmendiyên PCA ji bo RPS13 û RPL38. D. Analîza komkirina hiyerarşîk a bêçavdêrî ya proteînên rîbozomal ên sîtoplazmayî. E. Modela avahîsaziyê ya rîbozoma 80S (PDB: 4V6X) ku proteînên rîbozomal bi pirbûnên cûda di fîberên masûlkeyên îskeletî de ronî dike. F. Proteînên rîbozomal bi stoikyometrîyên cûda yên li nêzîkî kanala derketina mRNA-yê cih digirin.
Têgehên heterojenîte û pisporbûna rîbozomal berê hatine pêşniyar kirin, ku hebûna binpopulasyonên rîbozomal ên cuda (heterojenîte rîbozomal) dikare rasterast bandorê li wergerandina proteînê di tevn û şaneyên cuda de bike bi rêya wergerandina bijartî ya komên transkrîptên mRNA yên taybetî34 (pisporbûna rîbozomal). Ji bo destnîşankirina binpopulasyonên proteînên rîbozomal ên ku di fîberên masûlkeyên îskeletî de hev-derbirrîn têne kirin, me analîzek komkirina hiyerarşîk a bê çavdêrî ya proteînên rîbozomal di proteomê de pêk anî (Wêne 3D, Koma Daneyên Pêvek 8). Wekî ku tê hêvî kirin, proteînên rîbozomal li gorî celebê fîberê li ser bingeha MYH kom nebûn. Lêbelê, me sê komên cuda yên proteînên rîbozomal destnîşan kirin; koma yekem (koma_rîbozomal_1) bi RPL38 re hevrêzkirî ye û ji ber vê yekê di fîberên bi profîlek PC1 ya erênî de îfadeya wê zêde bûye. Koma duyem (koma_rîbozomal_2) bi RPS13 re hevrêzkirî ye û di fîberên bi profîlek PC1 ya neyînî de bilind bûye. Koma sêyem (ribosomal_cluster_3) di fîberên masûlkeyên îskeletî de îfadeya cûda ya hevrêzkirî nîşan nade û dikare wekî proteîna rîbozomal a "bingehîn" a masûlkeyên îskeletî were hesibandin. Her du komên rîbozomal 1 û 2 proteînên rîbozomal dihewînin ku berê hatine nîşandan ku wergerandina alternatîf rêk dixin (mînak, RPL10A, RPL38, RPS19, û RPS25) û bi awayekî fonksiyonel bandorê li pêşveçûnê dikin (mînak, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Li gorî encamên PCA, temsîliyeta heterojen a çavdêrîkirî ya van proteînên rîbozomal li seranserê fîberan jî domdarî nîşan da (Wêneya Pêvek 7C).
Ji bo dîtina cihê proteînên rîbozomal ên heterojen di nav rîbozomê de, me modelek avahîsaziyê ya rîbozoma 80S ya mirovî bikar anî (Protein Data Bank: 4V6X) (Wêne 3E). Piştî veqetandina proteînên rîbozomal ên ku aîdî komên rîbozomal ên cûda ne, cihên wan nêzîkî hev nebûn, ku ev yek nîşan dide ku rêbaza me nekariye dewlemendkirinê ji bo hin herêm/fraksiyonên rîbozomê peyda bike. Lêbelê, balkêş e ku rêjeya proteînên jêr-yekîneyên mezin di koma 2 de ji komên 1 û 3 kêmtir bû (Wêneya Pêvek 7D). Me dît ku proteînên bi stoikyometrîya guhertî di fîberên masûlkeyên îskeletî de bi giranî li ser rûyê rîbozomê cih digirin (Wêne 3E), ku lihevhatî ye bi şiyana wan a têkiliyê bi hêmanên cihê ketina rîbozomê ya hundurîn (IRES) re di nifûsên mRNA yên cûda de, bi vî rengî wergerandina bijartî hevrêz dikin. 40, 41 Wekî din, gelek proteînên bi stoikyometrîya guhertî di fîberên masûlkeyên îskeletî de li nêzî herêmên fonksiyonel ên wekî tunela derketina mRNA (Wêne 3F) cih digirin, ku bi awayekî bijartî dirêjkirina wergerandinê û rawestana peptîdên taybetî rêk dixin. 42 Bi kurtasî, daneyên me nîşan didin ku stoikyometrîya proteînên rîbozomal ên masûlkeyên îskeletî nehevsengiyê nîşan dide, ku di encamê de cûdahî di navbera fîberên masûlkeyên îskeletî de çêdibe.
Piştre me dest bi destnîşankirina îmzeyên fîberên bilez û hêdî-zivirandinê kir û mekanîzmayên rêkxistina wan a transkrîpsiyonê lêkolîn kir. Bi berawirdkirina komên fîberên bilez û hêdî-zivirandinê yên ku ji hêla UMAP ve di her du setên daneyan de hatine destnîşankirin (Wêne 1G–H û 4A–B), analîzên transkrîptomîk û proteomîk bi rêzê ve 1366 û 804 taybetmendiyên pir zêde destnîşan kirin (Wêne 4A–B, Setên Daneyên Pêvek 9–12). Me cûdahiyên bendewar di îmzeyên têkildarî sarkomeran (mînak, tropomyosin û troponin), girêdana ajîtasyon-girjbûnê (îzoformên SERCA), û metabolîzma enerjiyê (mînak, ALDOA û CKB) de dîtin. Wekî din, transkrîpt û proteînên ku ubîkwîtînasyona proteînê rêk dixin di fîberên bilez û hêdî-zivirandinê de bi awayekî cûda hatin îfade kirin (mînak, USP54, SH3RF2, USP28, û USP48) (Wêne 4A–B). Herwiha, gena proteîna mîkrobî RP11-451G4.2 (DWORF), ku berê hatiye nîşandan ku di nav celebên fîberên masûlkeyên berxê de bi awayekî cuda tê îfadekirin43 û çalakiya SERCA di masûlkeyên dil de zêde dike44, di fîberên masûlkeyên îskeletî yên hêdî de bi girîngî zêde bû (Wêne 4A). Bi heman awayî, di asta fîbera takekesî de, cûdahiyên girîng di îmzeyên naskirî de wekî îzoformên laktat dehydrogenaz ên têkildarî metabolîzmê (LDHA û LDHB, Wêne 4C û Wêneya Pêvek 8A)45,46 û her weha îmzeyên taybetî yên celebê fîberê yên berê nenas (wek IRX3, USP54, USP28, û DPYSL3) hatin dîtin (Wêne 4C). Di navbera setên daneyên transkrîptomîk û proteomîk de hevberdanek girîng a taybetmendiyên bi awayekî cuda têne îfadekirin hebû (Wêneya Pêvek 8B), û her weha korelasyonek guherîna qatê ku bi giranî ji hêla îfadeya cûda ya bêtir diyar a taybetmendiyên sarcomere ve tê rêve kirin (Wêneya Pêvek 8C). Bi taybetî, hin îmzeyan (mînak USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) tenê di asta proteomîk de rêziknameyek piştî-transkripsiyonê ya bihêz nîşan dan û profîlên îfadeya taybetî yên celebê fîbera lerzok a hêdî/lez hebûn (Wêneya Pêvek 8C).
Nexşeyên volkanê yên A û B ku komên hêdî û bilez didin ber hev, ji hêla nexşeyên nêzîkbûn û projeksiyona manifold a yekreng (UMAP) ve di Wêneyên 1G-H de hatine destnîşankirin. Xalên rengîn transkript an proteînên ku di FDR < 0.05 de bi girîngî cuda ne temsîl dikin, û xalên tarîtir transkript an proteînên ku di guherîna log > 1 de bi girîngî cuda ne temsîl dikin. Analîza îstatîstîkî ya du-alî bi karanîna testa DESeq2 Wald bi nirxên p yên sererastkirî yên Benjamini-Hochberg (transcriptomics) an rêbaza modela xêzik a Limma bi analîza Bayesian a empîrîk û dûv re sererastkirina Benjamini-Hochberg ji bo berhevdanên pirjimar (proteomics) hate kirin. C Nexşeyên îmzeyê yên gen an proteînên bi awayekî cûda îfadekirî yên bijartî di navbera fîberên hêdî û bilez de. D Analîza dewlemendkirinê ya transkript û proteînên bi awayekî cûda îfadekirî yên girîng. Nirxên hevgirtî di her du setên daneyan de dewlemendtir dibin, nirxên transkriptomê tenê di transkriptomê de dewlemendtir dibin, û nirxên proteomê tenê di proteomê de dewlemendtir dibin. Analîza îstatîstîkî bi karanîna pakêta clusterProfiler bi nirxên p yên sererastkirî yên Benjamini-Hochberg hate kirin. E. Faktorên transkrîpsiyonê yên taybetî yên celebê fîberê ku ji hêla SCENIC ve li gorî puanên taybetmendiya rêkxerê ya ji SCENIC-ê hatî wergirtin û îfadeya mRNA ya cûda di navbera celebên fîberan de hatine destnîşankirin. F. Profîla faktorên transkrîpsiyonê yên bijartî yên ku di navbera fîberên hêdî û bilez de bi cûdahî têne îfade kirin.
Piştre me analîzek zêde-nûnertiyê ya gen û proteînên ku bi awayekî cuda têne temsîlkirin pêk anî (Wêne 4D, Seta Daneyên Pêvek 13). Dewlemendkirina rê ji bo taybetmendiyên ku di navbera her du setên daneyan de cûda bûn, cûdahiyên bendewar eşkere kir, wekî pêvajoyên oksîdasyona β-asîda rûn û metabolîzma ketonê (fîberên hêdî), girjbûna mîyofîlament/masûlkeyan (fîberên bilez û hêdî, bi rêzê ve), û pêvajoyên katabolîk ên karbohîdratan (fîberên bilez). Çalakiya fosfataza proteîna serîn/treonîn di fîberên bilez de jî zêde bû, ji hêla taybetmendiyên wekî yekîneyên fosfatazê yên rêkûpêk û katalîtîk (PPP3CB, PPP1R3D, û PPP1R3A), ku tê zanîn ku metabolîzma glîkojenê rêkûpêk dikin (47) (Wêneyên Pêvek 8D–E). Rêyên din ên ku di fîberên bilez de dewlemend bûne, laşên pêvajoyê (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) di proteomê de (Wêneya Pêvek 8F), ku potansiyel di rêziknameya piştî-transkripsiyonê de beşdar in (48), û çalakiya faktora transkrîpsiyonê (SREBF1, RXRG, RORA) di transkrîptomê de (Wêneya Pêvek 8G) de ne. Fîberên hêdî di çalakiya oksîdoredûktazê (BDH1, DCXR, TXN2) (Wêneya Pêvek 8H), girêdana amîdê (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Wêneya Pêvek 8I), matrîksa derveyî hucreyê (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Wêneya Pêvek 8J), û çalakiya reseptor-lîgandê (FNDC5, SPX, NENF) (Wêneya Pêvek 8K) de dewlemend bûne.
Ji bo ku em têgihîştineke bêtir li ser rêziknameya transkrîpsiyonê ya bingehîn a taybetmendiyên celebê fîbera masûlkeyan a hêdî/lez bi dest bixin, me analîza dewlemendkirina faktorên transkrîpsiyonê bi karanîna SCENIC49 (Seta Daneyên Pêvek 14) pêk anî. Gelek faktorên transkrîpsiyonê di navbera fîberên masûlkeyan ên bilez û hêdî de bi girîngî dewlemend bûn (Wêne 4E). Ev faktorên transkrîpsiyonê yên wekî MAFA, ku berê bi pêşveçûna fîbera masûlkeyan a bilez ve girêdayî bû,50 û her weha çend faktorên transkrîpsiyonê yên ku berê bi bernameyên genê yên taybetî yên celebê fîbera masûlkeyan ve ne girêdayî bûn, di nav xwe de digirt. Di nav van de, PITX1, EGR1, û MYF6 faktorên transkrîpsiyonê yên herî dewlemend di fîberên masûlkeyan ên bilez de bûn (Wêne 4E). Berevajî vê, ZSCAN30 û EPAS1 (ku wekî HIF2A jî tê zanîn) faktorên transkrîpsiyonê yên herî dewlemend di fîberên masûlkeyan ên hêdî de bûn (Wêne 4E). Li gorî vê, MAFA di astên bilindtir de di herêma UMAP de ku bi fîberên masûlkeyan ên bilez re têkildar e, hate îfade kirin, dema ku EPAS1 xwedî qalibek îfadeya berevajî bû (Wêne 4F).
Ji bilî genên kodkirina proteînê yên naskirî, gelek biyotîpên RNA-yên ne-kodker hene ku dibe ku di rêkxistina pêşketin û nexweşiya mirovan de beşdar bibin. 51, 52 Di setên daneyên transkrîptomê de, çend RNA-yên ne-kodker taybetmendiya celebê fîberê nîşan didin (Wêne 5A û Seta Daneyên Pêvek 15), di nav de LINC01405, ku ji bo fîberên hêdî pir taybetî ye û tê ragihandin ku di masûlkeyan de ji nexweşên bi miyopatiya mîtokondrî kêm dibe. 53 Berevajî vê, RP11-255P5.3, ku bi gena lnc-ERCC5-5 re têkildar e (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, taybetmendiya celebê fîberê ya bilez nîşan dide. Hem LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) û hem jî RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) taybetmendiya masûlkeyên îskeletî nîşan didin (Wêneyên Pêvek 9A-B) û di nav cîrana genomîk a 1 Mb de tu genên girêkî yên naskirî nînin, ev yek nîşan dide ku ew rolek taybetî di rêkxistina celebên fîberan de dilîzin ne ku genên girêkî yên cîran rêk bixin. Profîlên îfadeya taybetî ya celebê fîberê hêdî/lez ên LINC01405 û RP11-255P5.3, bi rêzê ve, bi karanîna RNAscope hatin piştrast kirin (Wêneyên 5B-C).
A. Veguheztinên RNA-yên ne-kodker di fîberên masûlkeyan ên hêdî û bilez de bi girîngî têne rêkxistin. B. Wêneyên RNAscope-ê yên nûner ku taybetmendiya celebê fîbera hêdî û bilez a LINC01405 û RP11-255P5.3, bi rêzê ve nîşan didin. Pîvana çîpê = 50 μm. C. Pîvandina mîqdara îfadeya RNA-ya ne-kodker a taybetî ya celebê myofiber wekî ku ji hêla RNAscope ve hatî destnîşankirin (n = 3 biyopsî ji kesên serbixwe, berhevkirina fîberên masûlkeyan ên bilez û hêdî di nav her kesekî de). Analîza îstatîstîkî bi karanîna testa t-ya Xwendekarê du-alî hate kirin. Nexşeyên qutiyê navîn û çaryekên yekem û sêyemîn nîşan didin, bi muskên ku ber bi nirxên herî kêm û herî zêde ve nîşan didin. D. Herikîna karê ya nasnameya proteîna mîkrobî ya de novo (bi BioRender.com re hatî afirandin). E. Proteîna mîkrobî ya LINC01405_ORF408:17441:17358 bi taybetî di fîberên masûlkeya îskeletî ya hêdî de tê îfade kirin (n = 5 biyopsî ji beşdarên serbixwe, berhevkirina fîberên masûlkeyan ên bilez û hêdî di her beşdar de). Analîza îstatîstîkî bi karanîna rêbaza modela xêzikî ya Limm bi nêzîkatiyek Bayesian a empîrîk re hate kirin, û piştre rêbaza Benjamini-Hochberg ji bo berawirdkirinên pirjimar bi verastkirina nirxa p-yê hate kirin. Nexşeyên qutîkê medyan, çaryeka yekem û sêyemîn nîşan didin, bi çîpên ku ber bi nirxên herî zêde/kêmtirîn ve nîşan didin.
Di demên dawî de, lêkolînan nîşan dane ku gelek transkrîptên ne-kodker ên gumanbar proteînên mîkrobî yên transkrîpkirî kod dikin, ku hin ji wan fonksiyona masûlkeyan rêk dixin. 44, 55 Ji bo destnîşankirina proteînên mîkrobî yên bi taybetmendiya celebê fîberê ya potansiyel, me daneyên proteoma 1000 fîber bi karanîna pelek FASTA ya xwerû ku rêzikên transkrîptên ne-kodker (n = 305) dihewîne ku di daneyên transkrîptoma 1000 fîber de hatine dîtin (Wêne 5D) lêgerîn. Me 197 proteînên mîkrobî ji 22 transkrîptên cûda nas kirin, 71 ji wan bi awayekî cûda di navbera fîberên masûlkeyên îskeletî yên hêdî û bilez de hatine rêkxistin (Wêneya Pêvek 9C û Koma Daneyên Pêvek 16). Ji bo LINC01405, sê hilberên proteîna mîkrobî hatin nas kirin, ku yek ji wan taybetmendiya fîbera hêdî ya mîna transkrîptê xwe nîşan da (Wêne 5E û Wêneya Pêvek 9D). Bi vî rengî, me LINC01405 wekî genek ku proteînek mîkrobî ya taybetî ji bo fîberên masûlkeyên îskeletî yên hêdî kod dike nas kir.
Me ji bo taybetmendiya proteomîk a pîvanek mezin a fîberên masûlkeyan ên takekesî rêyek xebatê ya berfireh pêşxist û rêkxerên nehevsengiya fîberan di rewşên saxlem de nas kirin. Me ev rêyek xebatê bikar anî da ku fêm bikin ka miyopatiyên nemalîn çawa bandorê li nehevsengiya fîberên masûlkeyên îskeletî dikin. Miyopatiyên nemalîn nexweşiyên masûlkeyên mîras in ku dibin sedema qelsiya masûlkeyan û, di zarokên bandordar de, bi rêzek tevliheviyan re rû bi rû dimînin, di nav de tengasiya nefesê, skolyoz û tevgera lingan a sînorkirî. 19,20 Bi gelemperî, di miyopatiyên nemalîn de, guhertoyên patogenîk di genên wekî aktîn alfa 1 (ACTA1) de dibin sedema serdestiya pêkhateya miyofîbera fîbera hêdî-dizivirî, her çend ev bandor nehevseng be jî. Yek îstîsnayek berbiçav miyopatiya nemalîn a troponîn T1 (TNNT1) e, ku serdestiya fîberên bilez heye. Bi vî rengî, têgihîştinek çêtir a nehevsengiya bingehîn a disregulasyona fîbera masûlkeyên îskeletî de ku di miyopatiyên nemalîn de tê dîtin, dibe ku bibe alîkar ku têkiliya tevlihev di navbera van nexweşiyan û celebê miyofîberê de were eşkere kirin.
Li gorî kontrolên saxlem (n = 3 di her komê de), mîyofîberên ku ji nexweşên mîyopatiya nemalînê yên bi mutasyonên di genên ACTA1 û TNNT1 de hatine veqetandin, atrofî an dîstrofiya mîyofîberê ya berbiçav nîşan dan (Wêne 6A, Tabloya Pêvek 3). Ev ji ber mîqdara sînorkirî ya materyalê berdest ji bo analîza proteomîk dijwarîyên teknîkî yên girîng pêşkêş kir. Tevî vê yekê, me karî 2485 proteîn di 272 mîyofîberên îskeletî de tespît bikin. Piştî fîlterkirinê ji bo herî kêm 1000 proteînên hejmarîkirî li ser her fîberê, 250 fîber ji analîza biyoenformatîkê ya paşê re derbas bûn. Piştî fîlterkirinê, bi navînî 1573 ± 359 proteîn li ser her fîberê hatin hejmartin (Wêneya Pêvek 10A, Setên Daneyên Pêvek 17-18). Bi taybetî, tevî kêmbûna girîng a mezinahiya fîberê, kûrahiya proteomê ya nimûneyên nexweşên mîyopatiya nemalînê tenê bi nermî kêm bû. Herwiha, hilgirtina van daneyan bi karanîna pelên me yên FASTA (tevî transkrîptên ne-kodker) rê da me ku em pênc proteînên mîkrobî di mîyofîberên îskeletî yên nexweşên mîyopatiya nemalînê de nas bikin (Seta Daneyên Pêvek 19). Rêzeya dînamîk a proteomê bi girîngî firehtir bû, û proteînên tevahî di koma kontrolê de bi encamên analîzek proteomê ya 1000-fîber a berê re baş têkildar bûn (Wêneya Pêvek 10B-C).
A. Wêneyên mîkroskopîk ên ku atrofî an dîstrofiya fîberan û serdestiya celebên fîberên cûda li gorî MYH di miyopatiyên nemalîn ên ACTA1 û TNNT1 (NM) de nîşan didin. Pîvana pîvanê = 100 μm. Ji bo misogerkirina dubarekirina boyaxkirinê di nexweşên ACTA1 û TNNT1 de, biyopsiyên sê nexweşan du-sê caran (çar beş ji bo her rewşê) berî hilbijartina wêneyên nûner hatin boyaxkirin. B. Rêjeyên celebên fîberan di beşdaran de li gorî MYH. C. Nexşeya analîza pêkhateya sereke (PCA) ya fîberên masûlkeyên îskeletî di nexweşên bi miyopatiyên nemalîn û kontrolê de. D. Fîberên masûlkeyên îskeletî ji nexweşên bi miyopatiyên nemalîn û kontrolê li ser nexşeya PCA-yê ku ji 1000 fîberên ku di Wêne 2-an de hatine analîzkirin hatine destnîşankirin, hatine projekirin. Bo nimûne, nexşeyên volkanê yên ku cûdahiyên di navbera beşdarên bi miyopatiyên nemalîn ên ACTA1 û TNNT1 û kontrolê de, û di navbera beşdarên bi miyopatiyên nemalîn ên ACTA1 û TNNT1 de didin ber hev. Çemberên rengîn proteînên ku di π < 0.05 de bi girîngî cuda bûn nîşan didin, û xalên tarî proteînên ku di FDR < 0.05 de bi girîngî cuda bûn nîşan didin. Analîza îstatîstîkî bi karanîna rêbaza modela xêzikî ya Limma û rêbazên Bayesian ên empîrîk hate kirin, dû re jî sererastkirina nirxa p ji bo berawirdkirinên pirjimar bi karanîna rêbaza Benjamini-Hochberg hate kirin. H. Analîza dewlemendkirinê ya proteînên ku bi girîngî cudahîyên îfadekirî li seranserê proteomê û di fîberên celeb 1 û 2A de. Analîza îstatîstîkî bi karanîna pakêta clusterProfiler û nirxên p yên sererastkirî yên Benjamini-Hochberg hate kirin. I, J. Nexşeyên analîza pêkhateya sereke (PCA) ku bi matrîksa derveyî hucreyê û termên ontolojiya gena mîtokondrî (GO) hatine reng kirin.
Ji ber ku miyopatiyên nemalîn dikarin bandorê li rêjeya celebên miyofîberên ku MYH-ê îfade dikin di masûlkeyên îskeletî de bikin,19,20 me pêşî celebên miyofîberên ku MYH-ê îfade dikin li nexweşên bi miyopatiyên nemalîn û komên kontrolê lêkolîn kirin. Me celebê miyofîberê bi karanîna rêbazek bêalî ya ku berê ji bo ceribandina 1000 miyofîberê hatibû vegotin (Wêneyên Pêvek 10D-E) diyar kir û dîsa nekarîn miyofîberên 2X yên paqij nas bikin (Wêne 6B). Me bandorek nehevseng a miyopatiyên nemalîn li ser celebê miyofîberê dît, ji ber ku du nexweşên bi mutasyonên ACTA1 rêjeyek zêde ya miyofîberên celeb 1 hebû, lê du nexweşên bi miyopatiya nemalîn a TNNT1 rêjeyek kêmkirî ya miyofîberên celeb 1 hebû (Wêne 6B). Bi rastî, derbirîna MYH2 û îzoformên troponîna bilez (TNNC2, TNNI2, û TNNT3) di miyopatiyên ACTA1-nemalîn de kêm bû, lê derbirîna MYH7 di miyopatiyên TNNT1-nemalîn de kêm bû (Wêneya Pêvek 11A). Ev bi raporên berê yên guheztina celebê miyofîberê ya heterojen di miyopatiyên nemalîn de lihevhatî ye.19,20 Me van encaman bi îmmunohîstokîmyayê piştrast kir û dît ku nexweşên bi miyopatiya ACTA1-nemalîn xwedî serdestiya mîyofîberên celeb 1 bûn, lê nexweşên bi miyopatiya TNNT1-nemalîn xwedî şêwazek berevajî bûn (Wêne 6A).
Di asta proteoma yek-fîberî de, fîberên masûlkeyên îskeletî yên ji nexweşên miyopatiya nemalîn a ACTA1 û TNNT1 bi piraniya fîberên kontrolê re kom bûn, ku fîberên miyopatiya nemalîn a TNNT1 bi gelemperî herî zêde bandor dibin (Wêne 6C). Ev yek bi taybetî dema ku nexşeyên analîza pêkhateya sereke (PCA) ya fîberên pseudo-werbûyî ji bo her nexweşek têne xêzkirin diyar bû, ku nexweşên miyopatiya nemalîn a TNNT1 2 û 3 ji nimûneyên kontrolê herî dûr xuya dikin (Wêneya Pêvek 11B, Koma Daneyên Pêvek 20). Ji bo ku em çêtir fêm bikin ka fîberên ji nexweşên miyopatî çawa bi fîberên saxlem re têne berhev kirin, me agahdariya berfireh a ku ji analîza proteomîk a 1,000 fîberên ji beşdarên mezin ên saxlem hatine wergirtin bikar anî. Me fîberên ji seta daneyên miyopatî (nexweşên miyopatiya nemalîn a ACTA1 û TNNT1 û kontrol) li ser nexşeya PCA ya ku ji analîza proteomîk a 1000-fîber hatî wergirtin projey kir (Wêne 6D). Belavbûna celebên fîberên MYH li ser PC2 di fîberên kontrolê de dişibiya belavbûna fîberê ku ji analîza proteomîk a 1000-fîber hatî bidestxistin. Lêbelê, piraniya fîberan di nexweşên miyopatiya nemalînê de ber bi PC2 ve çûn, bi fîberên saxlem ên bilez-zivirandinê re li hev ketin, bêyî ku celebê fîbera MYH ya xwemalî çi be. Bi vî rengî, her çend nexweşên bi miyopatiya nemalînê ya ACTA1 dema ku bi rêbazên li ser bingeha MYH hatin pîvandin, guheztinek ber bi fîberên celeb 1 nîşan dan, hem miyopatiya nemalînê ya ACTA1 û hem jî miyopatiya nemalînê ya TNNT1 proteoma fîbera masûlkeyên îskeletî ber bi fîberên bilez-zivirandinê ve guheztin.
Piştre me her koma nexweşan rasterast bi komên kontrolê yên saxlem re berawird kir û bi rêzê ve 256 û 552 proteînên bi awayên cuda di mîyopatiyên nemalîn ên ACTA1 û TNNT1 de tespît kirin (Wêne 6E–G û Wêneya Pêvek 11C, Seta Daneyên Pêvek 21). Analîza dewlemendkirina genan kêmbûnek hevrêzkirî di proteînên mîtokondrî de eşkere kir (Wêne 6H–I, Seta Daneyên Pêvek 22). Bi awayekî ecêb, tevî serdestiya cûda ya celebên fîberan di mîyopatiyên nemalîn ên ACTA1 û TNNT1 de, ev kêmbûn bi tevahî serbixwe ji celebê fîberê ya li ser bingeha MYH bû (Wêne 6H û Wêneyên Pêvek 11D–I, Seta Daneyên Pêvek 23). Sê proteînên mîkrobî jî di mîyopatiyên nemalîn ên ACTA1 an TNNT1 de hatin rêkxistin. Du ji van mîkroproteînan, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (ku wekî LINC00598 an Lnc-FOXO1 jî tê zanîn) û ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), tenê di mîyofîberên celeb 1 de pirbûna cûda nîşan dan. Berê hatiye ragihandin ku ENSG00000215483_TR14_ORF67 di rêkxistina çerxa hucreyê de rolek dilîze. 56 Ji hêla din ve, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (ku bi LINC01798 re têkildar e) di hem mîyofîberên celeb 1 û hem jî celeb 2A de di mîyopatiya ACTA1-nemalîn de li gorî kontrolên saxlem zêde bû (Wêneya Pêvek 12A, Seta Daneyên Pêvek 24). Berevajî vê, proteînên rîbozomal bi piranî ji aliyê miyopatiya nemalîn ve nehatin bandorkirin, her çend RPS17 di miyopatiya nemalîn a ACTA1 de kêm bû (Wêne 6E).
Analîza dewlemendkirinê her wiha zêdebûna pêvajoyên pergala parastinê di miyopatiyên nemalîn ên ACTA1 û TNNT1 de eşkere kir, di heman demê de girêdana hucreyan di miyopatiya nemalîn a TNNT1 de jî zêde bû (Wêne 6H). Dewlemendkirina van faktorên derveyî hucreyê ji hêla proteînên matrîksa derveyî hucreyê ve hate nîşandan ku PCA di PC1 û PC2 de ber bi aliyekî neyînî ve diguhezînin (ango, ber bi fîberên herî bandorkirî ve) (Wêne 6J). Her du komên nexweşan zêdebûna îfadeya proteînên derveyî hucreyê yên ku di bersivên parastinê û mekanîzmayên tamîrkirina sarkolemmal de beşdar in nîşan dan, wekî annexin (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 û proteîna wan a têkiliyê S100A1159 (Wêneyên Pêvek 12B-C). Berê ev pêvajo di dîstrofiyên masûlkeyan de zêde bûye60 lê, bi zanîna me, berê bi miyopatiyên nemalîn ve nehatiye girêdan. Fonksiyona normal a vê makîneya molekulî ji bo tamîrkirina sarkolemmal piştî birîndarbûnê û ji bo hevgirtina mîyosîtên nû çêbûyî bi mîyofîberan re hewce ye58,61. Ji ber vê yekê, zêdebûna çalakiya vê pêvajoyê di her du komên nexweşan de bersivek telafîker a ji bo birîndarbûna ji ber bêîstîqrariya myofiberê nîşan dide.
Bandorên her miyopatiya nemalînê baş bi hev ve girêdayî bûn (r = 0.736) û hevgirtinek maqûl nîşan dan (Wêneyên Pêvek 11A-B), ku nîşan dide ku miyopatiya nemalînê ya ACTA1 û TNNT1 bandorên wekhev li ser proteomê hene. Lêbelê, hin proteîn tenê di miyopatiya nemalînê ya ACTA1 an TNNT1 de hatin rêkxistin (Wêneyên Pêvek 11A û C). Proteîna profibrotîk MFAP4 yek ji proteînên herî zêde di miyopatiya nemalînê ya TNNT1 de bû lê di miyopatiya nemalînê ya ACTA1 de bêguher ma. SKIC8, pêkhateyek ji kompleksa PAF1C ku berpirsiyarê rêkxistina transkrîpsiyona gena HOX e, di miyopatiya nemalînê ya TNNT1 de kêm bû lê di miyopatiya nemalînê ya ACTA1 de bandor nebû (Wêneya Pêvek 11A). Berawirdkirina rasterast a miyopatiya nemalîn a ACTA1 û TNNT1 kêmbûnek mezintir di proteînên mîtokondrî û zêdebûna proteînên pergala parastinê de di miyopatiya nemalîn a TNNT1 de eşkere kir (Wêne 6G–H û Wêneyên Pêvek 11C û 11H–I). Ev dane lihevhatî ne bi atrofî/dîstrofiya mezintir a ku di miyopatiya nemalîn a TNNT1 de li gorî miyopatiya nemalîn a TNNT1 tê dîtin (Wêne 6A), ku ev yek nîşan dide ku miyopatiya nemalîn a TNNT1 formek girantir a nexweşiyê temsîl dike.
Ji bo nirxandina ka bandorên çavdêrîkirî yên miyopatiya nemalînê li ser asta tevahiya masûlkeyan berdewam dikin an na, me analîzek proteomîk a girseyî ya biyopsiyên masûlkeyan ji heman koma nexweşên miyopatiya nemalînê ya TNNT1 pêk anî û wan bi kontrolê (n = 3 ji bo her komê) re berhev kir (Wêneya Pêvek 13A, Seta Daneyên Pêvek 25). Wekî ku tê hêvîkirin, kontrol di analîza pêkhateya sereke de bi hev ve girêdayî bûn, lê nexweşên miyopatiya nemalînê ya TNNT1 guherbariya nav-nimûneyê ya bilindtir nîşan dan ku dişibihe ya ku di analîza fîbera yekane de tê dîtin (Wêneya Pêvek 13B). Analîza girseyî proteînên bi awayên cûda îfadekirî (Wêneya Pêvek 13C, Seta Daneyên Pêvek 26) û pêvajoyên biyolojîkî (Wêneya Pêvek 13D, Seta Daneyên Pêvek 27) ku bi berhevdana fîberên takekesî hatine ronîkirin, ji nû ve hilberand, lê şiyana cûdakirina di navbera celebên fîberên cûda de winda kir û nekarî bandorên nexweşiya heterojen li seranserê fîberan hesab bike.
Bi hev re, ev daneyên nîşan didin ku proteomîkên yek-mîyofîber dikarin taybetmendiyên biyolojîk ên klînîkî yên ku bi rêbazên hedefgirtî yên wekî îmmunoblotting nayên tespît kirin, ronî bikin. Wekî din, ev daneyên sînorkirinên karanîna tîpkirina fîbera aktînê (MYH) bi tenê ji bo danasîna adaptasyona fenotipîk ronî dikin. Bi rastî, her çend guheztina celebê fîberê di navbera miyopatiyên nemalîn ên aktîn û troponîn de cûda dibe jî, her du miyopatiyên nemalîn tîpkirina fîbera MYH ji metabolîzma fîbera masûlkeyên îskeletî ber bi proteomek masûlkeya oksîdatîf a bileztir û kêmtir veqetînin.
Nehevsengiya hucreyî ji bo tevnvîsan girîng e ku daxwazên xwe yên cûrbecûr bicîh bînin. Di masûlkeyên îskeletî de, ev yek pir caran wekî celebên fîberê yên ku bi pileyên cûda yên hilberîna hêzê û westandinê têne xuyang kirin tê binav kirin. Lêbelê, eşkere ye ku ev tenê beşek piçûk ji guherbariya fîbera masûlkeyên îskeletî rave dike, ku ji ya ku berê dihat fikirîn pir guherbar, tevlihev û piralîtir e. Pêşketinên teknolojîk niha ronî li ser faktorên ku fîberên masûlkeyên îskeletî rêk dixin rijandin. Bi rastî, daneyên me destnîşan dikin ku fîberên celebê 2X dibe ku ne bin-cureyek fîbera masûlkeyên îskeletî ya cuda bin. Wekî din, me proteînên metabolîk, proteînên rîbozomal û proteînên girêdayî hucreyê wekî diyarkerên sereke yên nehevsengiya fîbera masûlkeyên îskeletî destnîşan kirin. Bi sepandina xebata me ya proteomîk li ser nimûneyên nexweşên bi mîyopatiya nematodê, me bêtir nîşan da ku celebkirina fîberê ya li ser bingeha MYH-ê nehevsengiya masûlkeyên îskeletî bi tevahî nîşan nade, nemaze dema ku pergal têk diçe. Bi rastî, bêyî ku celebê fîberê ya li ser bingeha MYH-ê çi be, mîyopatiya nematodê dibe sedema veguheztinek ber bi fîberên bileztir û kêmtir oksîdatîf ve.
Ji sedsala 19an vir ve fîberên masûlkeyên îskeletî têne dabeşkirin. Analîzên omîk ên vê dawiyê rê dane me ku em dest bi têgihîştina profîlên îfadeyê yên celebên cûda yên fîberên MYH û bersivên wan ên li hember teşwîqên cûda bikin. Wekî ku li vir hatî vegotin, nêzîkatiyên omîk di heman demê de ji bo hejmartina nîşankerên celebê fîberê ji rêbazên kevneşopî yên li ser bingeha antîkoran xwedî avantaja hesasiyetek mezintir in, bêyî ku xwe bispêrin hejmartina nîşankerek yekane (an çend) ji bo destnîşankirina celebek fîbera masûlkeyên îskeletî. Me herikînên xebatê yên transkrîptomîk û proteomîk ên temamker bikar anîn û encam yek kirin da ku rêziknameya transkrîpsiyonî û piştî-transkrîpsiyonê ya nehevsengiya fîberê di fîberên masûlkeyên îskeletî yên mirovan de lêkolîn bikin. Ev herikîna xebatê bû sedema têkçûna destnîşankirina fîberên celebê 2X-ê yên paqij di asta proteînê de di vastus lateralis ya koma me ya xortên saxlem de. Ev bi lêkolînên berê yên fîbera yekane re lihevhatî ye ku di vastus lateralis-a saxlem de <1% fîberên 2X-ê yên paqij dîtin, her çend ev divê di pêşerojê de di masûlkeyên din de were piştrast kirin. Nakokiya di navbera tespîtkirina fîberên 2X-ê yên hema hema paqij di asta mRNA-yê de û tenê fîberên 2A/2X-ê yên tevlihev di asta proteînê de şaş e. Derbirîna mRNA ya îzoforma MYH ne sîrkadî ye,67 ku ev yek nîşan dide ku ne mimkûn e ku em sînyala destpêkirina MYH2 di fîberên 2X yên ku di asta RNA de paqij xuya dikin "ji dest dane". Yek ravekirinek gengaz, her çend bi tevahî hîpotetîk be jî, dikare cûdahiyên di navbera îstîqrara proteîn û/an mRNA de di navbera îzoformên MYH de be. Bi rastî, tu fîbera bilez ji bo tu îzoforma MYH %100 paqij nine, û ne diyar e ka astên derbirîna mRNA ya MYH1 di rêza 70-90% de dê bibe sedema pirbûna MYH1 û MYH2 ya wekhev di asta proteînê de. Lêbelê, dema ku tevahiya transkrîptom an proteom tê hesibandin, analîza komê dikare bi bawerî tenê du komên cihêreng ên ku fîberên masûlkeyên îskeletî yên hêdî û bilez temsîl dikin, bêyî ku pêkhateya wan a rast a MYH çi be, nas bike. Ev lihevhatî ye bi analîzên ku nêzîkatiyên transkrîptomîk ên yek-nukleerî bikar tînin, ku bi gelemperî tenê du komên mîyonukleerî yên cihêreng nas dikin. 68, 69, 70 Her wiha, her çend lêkolînên proteomîk ên berê fîberên celebê 2X destnîşan kirine jî, ev fîber ji fîberên bilez ên din cuda kom nabin û tenê hejmareke piçûk ji proteînên bi awayekî cuda zêde nîşan didin li gorî celebên din ên fîberê yên li ser bingeha MYH. 14 Ev encam pêşniyar dikin ku divê em vegerin ser nêrîna destpêka sedsala 20-an a li ser dabeşkirina fîberên masûlkeyan, ku fîberên masûlkeyên îskeletî yên mirovan ne li ser bingeha MYH li sê çînên cuda, lê li ser bingeha taybetmendiyên wan ên metabolîk û girêbestî li du koman dabeş kir. 63
Girîngtir, divê nehevsengiya mîyofîberê li gorî gelek pîvanan were nirxandin. Lêkolînên "omîk" ên berê ber bi vê alî ve nîşan dane, ku pêşniyar dikin ku fîberên masûlkeyên îskeletî komên cuda çênakin lê li gorî berdewamiyekê têne rêzkirin. 11, 13, 14, 64, 71 Li vir, em nîşan didin ku, ji bilî cûdahiyên di taybetmendiyên girêkî û metabolîk ên masûlkeyên îskeletî de, mîyofîber dikarin bi taybetmendiyên têkildarî têkiliyên hucre-hucre û mekanîzmayên wergerandinê werin cûdakirin. Bi rastî, me nehevsengiya rîbozomê di fîberên masûlkeyên îskeletî de dît ku beşdarî nehevsengiyê dibe serbixwe ji celebên fîberên hêdî û bilez. Sedema bingehîn a vê nehevsengiya mîyofîberê ya girîng, serbixwe ji celebê fîberê hêdî û bilez, ne diyar e, lê dibe ku ew nîşanî rêxistina fezayî ya taybetî di nav komên masûlkeyan de bide ku bi awayekî çêtirîn bersivê didin hêz û barên taybetî,72 ragihandina taybetî ya hucreyî an organî bi celebên hucreyên din re di mîkrojîngeha masûlkeyan de73,74,75 an cûdahiyên di çalakiya rîbozomê de di nav mîyofîberên takekesî de. Bi rastî, heteroplazmiya rîbozomal, çi bi rêya guhertina paralog a RPL3 û RPL3L an jî di asta 2′O-metîlasyona rRNA de, hatiye nîşandan ku bi hîpertrofiya masûlkeyên îskeletî ve girêdayî ye76,77. Serlêdanên pir-omîk û fezayî yên ku bi taybetmendiya fonksiyonel a mîyofîberên takekesî re têne hev kirin, dê têgihîştina me ya biyolojiya masûlkeyan di asta pir-omîk de bêtir pêş bixe78.
Bi analîzkirina proteomên mîyofîberên yekane ji nexweşên bi mîyopatiyên nemalîn, me kêrhatî, bandor û sepandina proteomîkên mîyofîberên yekane jî nîşan da ji bo ronîkirina patofîzyolojiya klînîkî ya masûlkeyên îskeletî. Wekî din, bi berhevkirina herikîna karê me bi analîza proteomîk a gerdûnî, em karîn nîşan bidin ku proteomîkên mîyofîberên yekane heman kûrahiya agahdariyê wekî proteomîkên tevna gerdûnî dide û vê kûrahiyê bi hesabkirina heterojenîteya navbera fîberan û celebê mîyofîberê dirêj dike. Ji bilî cûdahiyên bendewar (her çend guhêrbar bin jî) di rêjeya celebê fîberê de ku di mîyopatiyên nemalîn ên ACTA1 û TNNT1 de li gorî kontrolên saxlem hatine dîtin,19 me her weha ji nû ve avakirina oksîdatîf û derveyî hucreyê serbixwe ji guheztina celebê fîberê ya bi navbeynkariya MYH-ê dît. Fîbroz berê di miyopatiyên nemalîn ên TNNT1 de hatiye ragihandin.19 Lêbelê, analîza me li ser vê vedîtinê ava dibe û her weha asta zêdebûna proteînên têkildarî stresê yên derveyî hucreyê, wekî annexin, ku di mekanîzmayên tamîrkirina sarkolemmal de beşdar in, di miyofîberên nexweşên bi miyopatiyên nemalîn ên ACTA1 û TNNT1 de eşkere dike.57,58,59 Di encamê de, asta annexin a zêde di miyofîberên nexweşên bi miyopatiya nemalîn de dibe ku bersivek hucreyî temsîl bike ji bo tamîrkirina miyofîberên atrofîk ên giran.
Her çend ev lêkolîn heta niha mezintirîn analîza omîk a tevahiya masûlkeyan a yek-fîberî temsîl dike jî, ew bê sînorkirin nîne. Me fîberên masûlkeyên îskeletî ji nimûneyek nisbeten piçûk û homojen a beşdaran û masûlkeyek yekane (vastus lateralis) veqetandin. Ji ber vê yekê, ne gengaz e ku hebûna nifûsa fîberên taybetî li seranserê celebên masûlkeyan û di asta herî bilind a fîzyolojiya masûlkeyan de were derxistin. Mînakî, em nekarin îhtîmala derketina komek ji fîberên ultrafast (mînak, fîberên 2X yên paqij) di werzişvanên sprint û/an werzişvanên hêzê yên pir perwerdekirî de ji holê rakin79 an di demên bêçalakiya masûlkeyan de66,80. Wekî din, mezinahiya nimûneya sînorkirî ya beşdaran rê li ber me girt ku em cûdahiyên zayendî di nehevsengiya fîberan de lêkolîn bikin, ji ber ku tê zanîn ku rêjeyên celebên fîberan di navbera mêr û jinan de cûda dibin. Wekî din, em nekarîn analîzên transkrîptomîk û proteomîk li ser heman fîberên masûlkeyan an nimûneyên ji heman beşdaran bikin. Her ku em û yên din analîzên yek-hucreyî û yek-mîyofîberê bi karanîna analîza omîkê ji bo bidestxistina têketina nimûneya pir kêm (wekî ku li vir di analîza fîberan ji nexweşên bi mîyopatiya mîtokondrî de tê nîşandan) baştir dikin, derfeta ku nêzîkatiyên pir-omîk (û fonksiyonel) di nav fîberên masûlkeyan ên yekane de werin hevber kirin eşkere dibe.
Bi tevayî, daneyên me ajokarên transkrîpsiyonî û piştî-transkrîpsiyonê yên nehevsengiya masûlkeyên îskeletî destnîşan dikin û rave dikin. Bi taybetî, em daneyên ku dogmayek demdirêj di fîzyolojiya masûlkeyên îskeletî de ku bi pênaseya klasîk a celebên fîberan a li ser bingeha MYH ve girêdayî ye, pêşkêş dikin. Em hêvî dikin ku nîqaşê nû bikin û di dawiyê de têgihîştina xwe ya dabeşkirin û nehevsengiya fîberên masûlkeyên îskeletî ji nû ve binirxînin.
Çardeh beşdarên Qefqasî (12 mêr û 2 jin) bi dilxwazî ​​​​qebûl bûn ku beşdarî vê lêkolînê bibin. Lêkolîn ji hêla Komîteya Etîkê ya Nexweşxaneya Zanîngeha Ghent (BC-10237) ve hate pejirandin, li gorî Danezana Helsînkî ya 2013-an tevgeriya û li ClinicalTrials.gov (NCT05131555) hate tomar kirin. Taybetmendiyên giştî yên beşdaran di Tabloya Pêvek 1 de têne pêşkêş kirin. Piştî wergirtina razîbûna agahdar a devkî û nivîskî, beşdaran berî tevlêbûna dawî ya lêkolînê muayeneyek bijîşkî derbas kirin. Beşdar ciwan (22-42 salî), saxlem (bê nexweşiyên bijîşkî, bê dîroka cixarekêşanê) û bi nermî çalak bûn. Girtina oksîjenê ya herî zêde bi karanîna ergometreyek gav-gav ji bo nirxandina tenduristiya laşî wekî ku berê hatî vegotin hate destnîşankirin. 81
Nimûneyên biyopsiya masûlkeyan sê caran, bi navbera 14 rojan, di rewşa bêhnvedanê û rojîgirtinê de hatin berhevkirin. Ji ber ku ev nimûne wekî beşek ji lêkolînek mezintir hatin berhevkirin, beşdaran 40 deqîqe berî biyopsiyê plasebo (laktoz), dijberê reseptora H1 (540 mg fexofenadine), an dijberê reseptora H2 (40 mg famotidine) xwarin. Me berê nîşan da ku ev dijberên reseptora hîstamîn bandorê li werzişa masûlkeyên îskeletî yên bêhnvedanê nakin81, û di nexşeyên kontrola kalîteyê yên me de (Wêneyên Pêvek 3 û 6) de tu kombûnek têkildarî rewşê nehat dîtin. Parêzek standardkirî (41.4 kcal/kg giraniya laş, 5.1 g/kg giraniya laş karbohîdrat, 1.4 g/kg giraniya laş proteîn, û 1.6 g/kg giraniya laş rûn) 48 demjimêran berî her roja ceribandinê hate domandin, û taştêyek standardkirî (1.5 g/kg giraniya laş karbohîdrat) di sibeha roja ceribandinê de hate xwarin. Di bin anesteziya herêmî de (0.5 ml 1% lîdokaîn bê epinephrine), biyopsiyên masûlkeyan ji masûlkeya vastus lateralis bi karanîna aspirasyona Bergström a perkutan hatin girtin.82 Nimûneyên masûlkeyan tavilê di RNAlater de hatin bicihkirin û heta ku fîber bi destan were parçekirin (heta 3 rojan) di 4°C de hatin hilanîn.
Çend komên mîyofîberên nû hatine îzolekirin di taseke kulturê de bo navgîna RNAlater a nû hatin veguhastin. Piştre mîyofîberên takekesî bi destan bi karanîna mîkroskopek stereo û pincarek zirav hatin parçekirin. Bîst û pênc fîber ji her biyopsiyê hatin parçekirin, bi taybetî bal kişandin ser hilbijartina fîberan ji deverên cûda yên biyopsiyê. Piştî parçekirinê, her fîber bi nermî di 3 μl tampona lîzê (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) de hat danîn ku enzîmên proteînaz K û DNase tê de hene da ku proteîn û DNAya nexwestî werin rakirin. Dû re lîza hucreyê û rakirina proteîn/DNAyê bi vortekskirina kurt, zivirandina şilavê di mîkrosantrifûjekê de, û înkubasyona li germahiya odeyê (10 deqe) dest pê kir. Piştre lîzat di çerxerêyek germî (T100, Bio-Rad) de li 37°C ji bo 5 deqeyan, 75°C ji bo 5 deqeyan, û dû re tavilê di -80°C de heta pêvajoya din hate hilanîn.
Pirtûkxaneyên RNA yên polîadenîlkirî yên lihevhatî yên Illumina ji 2 µl lîzatê myofiber bi karanîna QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen) hatin amadekirin. Rêbazên berfireh dikarin di rêbernameya çêker de werin dîtin. Pêvajo bi senteza cDNA ya zincîra yekem bi transkrîpsiyona berevajî dest pê dike, di dema wê de nasnameyên molekulî yên bêhempa (UMI) û barkodên i1 yên taybetî yên nimûneyê têne destnîşan kirin da ku komkirina nimûneyan misoger bikin û guherbariya teknîkî di dema pêvajoya paşîn de kêm bikin. Dûv re cDNA ji 96 myofiberan tê kom kirin û bi morîkên magnetîkî tê paqij kirin, piştî vê yekê RNA tê rakirin û senteza zincîra duyemîn bi karanîna primerên rasthatî tê kirin. Pirtûkxane bi morîkên magnetîkî tê paqij kirin, etîketên i5/i7 yên taybetî yên hewzê têne zêdekirin, û PCR tê zêdekirin. Gaveke paqijkirina dawîn pirtûkxaneyên lihevhatî yên Illumina çêdike. Kalîteya her hewza pirtûkxaneyê bi karanîna Kîta Analîza DNA ya Parçeyên Biçûk ên Hesasiyeta Bilind (Agilent Technologies, DNF-477-0500) hate nirxandin.
Li ser bingeha hejmartina Qubit, kombûn di konsantrasyonên ekîmolar (2 nM) de bêtir hatin komkirin. Kombûna encam dûv re li ser amûrek NovaSeq 6000 di moda standard de bi karanîna Kîta Reagentê ya NovaSeq S2 (1 × 100 nukleotîd) bi barkirina 2 nM (4% PhiX) hate rêzkirin.
Xeta me li ser xeta analîzkirina daneyên QuantSeq Pool a Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) hatiye avakirin. Daneyên pêşî bi bcl2fastq2 (v2.20.0) li ser bingeha endeksa i7/i5 hatin demultiplekskirin. Xwendina 2 dû re bi idemux (v0.1.6) li ser bingeha barkoda nimûneya i1 hate demultiplekskirin û rêzikên UMI bi umi_tools (v1.0.1) hatin derxistin. Xwendin dû re bi cutadapt (v3.4) di gelek doran de hatin qutkirin da ku xwendinên kurt (<20 di dirêjahiyê de) an xwendinên ku tenê ji rêzikên adaptor pêk tên werin rakirin. Xwendin dû re bi karanîna STAR (v2.6.0c) bi genoma mirovan re hatin hevrêzkirin û pelên BAM bi SAMtools (v1.11) hatin endekskirin. Xwendinên dubare bi karanîna umi_tools (v1.0.1) hatin rakirin. Di dawiyê de, jimartina hevrêzkirinê bi karanîna featureCounts di Subread (v2.0.3) de hate kirin. Kontrolkirina kalîteyê bi karanîna FastQC (v0.11.9) di çend qonaxên navîn ên boriyê de hate kirin.
Hemû pêvajoyên din ên biyoenformatîkê û dîtbarîkirin di R (v4.2.3) de hatin kirin, bi giranî bi karanîna herikîna xebatê ya Seurat (v4.4.0). 83 Ji ber vê yekê, nirxên UMI yên takekesî û matrîsên metadatayê veguherî objektên Seurat. Genên ku di kêmtir ji 30% ji hemû fîberan de dihatin îfadekirin hatin rakirin. Nimûneyên kalîteya nizm li ser bingeha kêmtirîn sînorê 1000 nirxên UMI û 1000 genên tespîtkirî hatin rakirin. Di dawiyê de, 925 fîber hemû gavên fîlterkirina kontrola kalîteyê derbas kirin. Nirxên UMI bi karanîna rêbaza Seurat SCTransform v2 hatin normalîzekirin, 84 tevî hemû 7418 taybetmendiyên tespîtkirî, û cudahîyên di navbera beşdaran de hatin paşvekişandin. Hemû metadatayên têkildar dikarin di Seta Daneyên Pêvek 28 de werin dîtin.